造血干细胞和骨髓微环境研究进展

1. 研究背景

1.1 造血干细胞的起源与发育

造血干细胞(hematopoietic stem cell, HSC)是一群数目稀少、具有自我更新能力和可生成各种血细胞及免疫细胞的先祖细胞,多数以静息状态存在于骨髓中。在哺乳动物中,造血干细胞(HSC)在整个成年期都在骨髓中进行造血,在那里它们产生维持血细胞数量和免疫功能所需的成熟细胞。造血过程的起源是一个很有意思的问题,已有研究表明哺乳动物的造血是由胚胎发生过程中数以百计的中胚层和内皮前提细胞建立的(1),同时阐明造血干细胞异质性的胚胎起源可能性也是必要的,造血干细胞的不同细胞命运可能在胚胎阶段已经就被决定了,但是具体的分子机制尚未明确。

造血干细胞分化是通过一个逐步的过程发生的,从多到寡,再到单能祖细胞到成熟血细胞(2)。随着单细胞分辨率组学等新技术的发展,很多研究表明,异质性是造血干细胞及其子代的共同特征,同时也鉴定很多新造血细胞群体,正常和转化的造血细胞。单细胞通过拟时序研究表明,造血是一个连续的分化过程:在细胞水平,未分化造血干和祖细胞逐渐分化为谱系限制细胞,干细胞和祖细胞的界限现在变得越来越模糊,中间态的细胞可能对分化过程具有重要决定作用;在分子水平,表现出持续分化过程的特征是对细胞分裂相关基因的抑制和对谱系特异性基因的激活(3,4)。尽管很多研究表明早期造血是一个连续的过程(5),也有可能是不同的群体,这些需要在表观遗传水平上和是否是由于共享生物学过程(细胞周期)的异质性产生的偏差。

造血稳态的维持,造血干细胞存在于造血组织内特殊的微环境或生态位中,促进造血细胞的维持和调节造血细胞的产生(6)。当发生应激和病变时,HSC可被迅速激活进而增殖分化成下游成熟细胞来维持机体的造血稳态,然而是哪些HSC群体和造血祖细胞维持造血稳态还存在矛盾,同时也表明造血系统的层次路线图是灵活的,原生造血和应激造血可能具有不同的谱系分化路径,以适应不同的生理条件(7),因而应激和正常之间有很大的细胞异质性。骨髓微环境对维持造血稳态以及应激下的重建也具有重要作用,了解其如何重塑不同HSPC亚群的相对含量和可能的分化轨迹具有重要意义,然而这方面的细胞和分子反馈机制研究的较少(8)。

1.2 骨髓微环境与应激状态的骨髓微环境

HSC正常的生成和维持离不开骨髓造血微环境(Niche)。造血干细胞存在于骨髓中特殊的生态位中,HSC的生态位在窦周附近,由LepR+基质细胞以及内皮细胞合成HSC所需要的因子(9)。和HSCs一样,限制性造血祖细胞在存在特定的生态位中,也需要LepR+基质细胞分泌的因子维持,但是有些来自成骨细胞。另外,有些限制性先祖细胞的小生境靠近血窦,有些靠近小血管以及骨内膜,在空间上与HSC生态位具有差异性。同时,尽管有些都依赖LepR+基质细胞维持且都在窦周,但是他们的空间位置也存在差异。在窦周可能具有不同的区域来维持这些不同类型的干细胞和先祖细胞。已有的研究发现了很多小生境,一些早期淋巴祖细胞依赖于来自LepR+细胞的IL-7,目前尚不清楚它们是位于小动脉周围还是窦周围;同时也尚不清楚这些淋巴祖细胞亚型互相在生态位是否有重叠或者它们是否代表淋巴发育的不同阶段(10)。骨髓细胞的异质性是一个非常有意义的研究方向。单细胞转录组学的发展有利于更加好的了解这些异质性。另外,除了分泌生长因子之外,其他生态位对于干细胞和先祖细胞的功能有何作用,细胞分化时这些生态位之间的相互作用是如何的,以及生态位之间视图和感知细胞消耗以及维持平衡的,对进一步深入了解骨髓生态位的分子机制具有重要作用(9, 11)。

应激状态下的骨髓微环境会产生各种变化,其中重要的一个方面是造血再生,在造血系统恶性肿瘤中,化疗或者放疗都会破坏骨髓中的窦状网络结构,脂肪细胞可能通过多种机制促进造血干细胞的再生和造血(11),例如合成生态位SCF因子,促进造血干细胞维持和骨髓消融后的造血再生。同时必要的时候可以通过骨髓外,如脾脏、肝脏进行髓外造血(EMH),脾脏的EMH生态位已经收到重视(12),肝脏的生态位还未被定性,研究EMH的生态位对于维持HSC的稳态是非常有意义的方向。再而,生长因子在应激和稳态下的差异性,许多生长因子、膜结合配体和其他分泌的基因产物对于骨髓消融后造血干细胞的再生和造血是必要的,但对于稳定状态下造血干细胞的维持和造血是可有可无的,目前尚不清楚这些因子通过作用于基质细胞、造血干/祖细胞或两者在多大程度上促进造血再生(13)。

未来运用基因和成像技术,如最近兴起的空间转录组和单细胞转录组学,可以绘制出骨髓和造血干细胞的三维图谱和谱系图谱,将特定的谱系限制阶段或分化与特定的微生态联系起来,解析微生态之间的相互联系,探究造血过程中的平衡机制,为体外造血分化扫清障碍,同时靶向微环境中相关因子可能干预疾病的进展,将极大地促进临床应用的扩展。

2.研究目的

2.1 造血系统的发育过程

基于单细胞转录组和ATAC等组学方法,研究造血干细胞的自我更新和谱系分化潜在的分子功能和生物过程,探索HSC谱系分化与细胞状态的变化的协调机制。 基于多组学数据分析,研究早期造血是连续的生物过程还是不同的细胞群体产生;鉴定新的造血干细胞和先祖细胞亚群,探索造血细胞异质性;研究中间态分化的细胞,理清这些中间态细胞在分化过程中具有的重要决定作用,最后比较正常造血和应激造血之间在细胞、分子之间的差异性。

2.2 骨髓微生态

解决骨髓空间转录组样本制备的瓶颈,构建骨髓微生态的空间转录组图谱,探索骨髓生态位之间的相互作用,研究特定微环境对造血分化过程的影响以及造血稳态的作用;结合单细胞转录组学数据,研究骨髓中细胞在特定空间中细胞比例对造血功能的影响;除了挖掘新的生长因子,基于系统生物学的角度解释造血平衡的机制。理清特定病理条件下,骨髓微环境对于造血再生HSC的空间变化特征,挖掘可以靶向微环境的相关因子,研究其进一步的作用机制。

3. 研究内容

3.1 多组学动态网络生物标志物研究HSC的发育过程

首先,基于实验室已有的单细胞转录组学的数据以及干细胞数据库,可以在细胞层面上研究不同条件下新的祖细胞群体、正常和转化的造血细胞的异质性,在分子层面研究自我更新潜能和谱系发育程序的激活等核心调控机制。其次,整合其他组学,如单细胞ATAC等表观数据,研究早期的造血是连续的还是不同的群体。基于拟时序分析,研究特定HSC与先祖细胞的发育轨迹。从两方面研究,对于正常造血过程,理清楚造血干细胞的分化发育过程;对于病理疾病过程,理清楚细胞组成,从细胞水平和分子水平解释白血病形成的机制。最后,基于系统生物学,使用动态网络生物标志物(DNB)等新方法(14),对HSC等细胞分化过程中的临界状态进行研究,以及转变过程中的中间态细胞的注释和功能进行研究,并对获得的新的因子和候选基因进行功能研究。

3.2 骨髓微环境空间转录组图谱的构建

首先,构建正常和病理条件下小鼠骨髓切面等空间转录组图谱,研究骨髓中造血干/祖细胞等细胞的空间位置分布,研究HSC与先祖细胞生态位之间的双向通信;其次,整合单细胞转录组数据,研究骨髓生态位的相互作用是否以及如何影响不同造血干细胞亚群活性以及造血干细胞的分化过程分子机制,进一步了解应激状态骨髓微生态对不同HSPC亚群的相对丰度和可能的分化轨迹,研究维持和重建稳态的细胞和分子调控反馈机制;最后,通过系统生物学的方式,运用动态网络生物标志物的方式,挖掘具有时空特异性的中间过渡态细胞,并对其进一步注释,从系统生物学角度,研究骨髓微环境对造血稳态的机制。

4. 研究方法

4.1 单细胞组学

单细胞转录组测序(single-cell RNAseq)可以对单个细胞进行无偏、高通量和高分辨率的转录组分析。不同于混样的 RNA 测序,可以解释新的生物学特性,包括组织形成、动态变化、以及细胞间的影响。空间转录组学,可以结合影像数据,了解细胞之间的关系以及它们在组织样本中的相对位置,解析骨髓的生态位空间信息,对进一步理解疾病病理学至关重要。

4.2 系统生物学:动态网络生物标志物

造血干细胞(HSC)谱系分化是一个连续的过程,从系统生物学角度研究这个过程很有必要。造血分化是一个连续的过程,都存在一个临界时期。不同与已有的生物标志物是基于差异分析或者无尺度网络中核心基因的方法来进行挖掘的方法,这些方法只能挖掘静态的生物标志物;而忽略了大多数疾病以及生物学系统变化过程(14)。动态网络生物标志物是一种基于稳健的隐马尔可夫数学模型,对具有时序的组学数据进行网络水平的建模,主要用于生物学系统的临界时期或者临界状态进行鉴定,很适合生物学过程的研究,以及在很多肿瘤以及免疫过程中得到了很好的应用(15)。动态网络生物标志物的方法可以整合单细胞转录组和空间转录组学的信息,为挖掘具有时空特异性的候选分子提供了可行性,很适合研究骨髓微环境的基因与时空特异性。

4.3 小鼠模型

条件性敲除小鼠(Conditional Knockout,CKO)是指对小鼠中特定的细胞类型或者在特定的时期构建基因敲除小鼠。由于其并不是用于全身性敲除,很少产生致死性,所以广泛用于很多生物学研究。例如,胚胎发育学研究(16)。可以用于研究骨髓特定基因敲除对骨髓微环境的影响等。

5. 期待的成果

整合多组学数据,探究造血干细胞谱系发育的动态生物学过程,构建正常和病理条件下的骨髓空间转录组图谱,研究骨髓生态位在造血稳态和造血再生中的作用;同时发表一到两篇具有代表性的原创性科研成果。

参考文献

  1. Ganuza M, et al. (2017) Lifelong haematopoiesis is established by hundreds of precursors throughout mammalian ontogeny. Nat Cell Biol 19(10):1153-1163.
  2. Morrison SJ, Uchida N, & Weissman IL (1995) The biology of hematopoietic stem cells. Annual review of cell and developmental biology 11:35-71.
  3. Buenrostro JD, et al. (2018) Integrated Single-Cell Analysis Maps the Continuous Regulatory Landscape of Human Hematopoietic Differentiation. Cell 173(6):1535-1548.e1516.
  4. Macaulay IC, et al. (2016) Single-Cell RNA-Sequencing Reveals a Continuous Spectrum of Differentiation in Hematopoietic Cells. Cell reports 14(4):966-977.
  5. Velten L, et al. (2017) Human haematopoietic stem cell lineage commitment is a continuous process. Nature Cell Biology 19(4):271-281.
  6. Shen J, Wang ZY, & Cheng T (2017) Generation of engraftable hematopoietic stem cells from human pluripotent stem cells. Zhonghua Xue Ye Xue Za Zhi 38(3):257-260.
  7. Zhang Y, Gao S, Xia J, & Liu F (2018) Hematopoietic Hierarchy - An Updated Roadmap. Trends Cell Biol 28(12):976-986.
  8. Laurenti E & Gottgens B (2018) From haematopoietic stem cells to complex differentiation landscapes. Nature 553(7689):418-426.
  9. Comazzetto S, Shen B, & Morrison SJ (2021) Niches that regulate stem cells and hematopoiesis in adult bone marrow. Dev Cell 56(13):1848-1860.
  10. Chen JY, et al. (2016) Hoxb5 marks long-term haematopoietic stem cells and reveals a homogenous perivascular niche. Nature 530(7589):223-227.
  11. Tikhonova AN, et al. (2019) The bone marrow microenvironment at single-cell resolution. Nature 569(7755):222-228.
  12. Inra CN, et al. (2015) A perisinusoidal niche for extramedullary haematopoiesis in the spleen. Nature 527(7579):466-471.
  13. Crane GM, Jeffery E, & Morrison SJ (2017) Adult haematopoietic stem cell niches. Nature Reviews Immunology 17(9):573-590.
  14. Lesterhuis WJ, et al. (2017) Dynamic versus static biomarkers in cancer immune checkpoint blockade: unravelling complexity. Nature reviews. Drug discovery 16(4):264-272.
  15. Liu H, et al. (2021) Single-cell transcriptomics reveal DHX9 in mature B cell as a dynamic network biomarker before lymph node metastasis in CRC. Molecular Therapy - Oncolytics 22:495-506.
  16. McGill BE, et al. (2018) Abnormal Microglia and Enhanced Inflammation-Related Gene Transcription in Mice with Conditional Deletion of Ctcf in Camk2a-Cre-Expressing Neurons. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience 38(1):200-219.