文献分享01：Unraveling bone marrow architecture

今天给大家分享一篇对Baccin等发表的单细胞与空转整合分析骨髓微环境¹²的评论。

骨髓 (Bone Marrow，BM) 中不同类型的间质细胞(stromal cells) 形成支持血细胞分化和确保主要血液谱系的终身造血的微环境 (Niches)。该篇文章结合单细胞、空间转录组 (spatial transcriptomics) 以及成像技术推断骨髓微环境中的细胞组成和空间结构。

造血干细胞和先祖细胞产生主要血液谱系细胞，离不开骨髓中间质细胞的支持。这些间质细胞组成多细胞的微生态，产生细胞因子(cytokines)，趋化因子(chemokines)，粘附分子(adhesion molecules)和其他的因子，调节血液细胞的自我更新和分化。因此定义微环境的细胞组成，它们在组织中的位置以及它们分泌的信号因子对于理解骨髓如何保障造血平衡是必不可少的。对骨髓微环境的细胞组成和结构的深入研究主要集中在对造血干细胞生态位的研究。在这些研究中，荧光报告被用于观察HSC的定位以及它们相关的候选生态位细胞，以及对特定的间质细胞进行条件消融或者细胞特异性敲除调控因子来鉴定关键的因素。在这些和其他研究中，现在认识到大部分HSCs位于窦(sinusoids)和巨核细胞(megakaryocytes)附近，少部分位于小动脉(arterioles)和骨内膜(endosteum)附近。内皮细胞(endothelial cells)的不同亚型、血管周细胞(perivascular cells) 和其他间质和造血细胞已经被鉴定为这些HSC生态位的组成成分，并且对生态位的作用具有重要贡献。然而，对于窦、小血管和骨内膜的细胞组成和一些重要调控细胞因子（如CXCL12和SCF）的来源仍然存在争议。尽管该领域的主要焦点一直是HSC生态位的鉴定，但也有证据表明存在特定对于谱系化的先祖细胞的生态位，但是这些问题仍然不清楚。Baccin等人揭示了骨髓小动脉、窦、非血管、骨内膜和骨内膜下区域之间令人惊讶的细胞和功能异质性并阐明了调节性细胞因子的主要来源。

Baccin等人首先运用了基于液滴的单细胞RNA测序(droplet-based RNAseq)刻绘了骨髓的细胞组成，主要集中在主要的造血干细胞和间质细胞谱系。这些初步分析解释了骨髓间质细胞的高度异质性。然后作者使用激光捕获显微解剖（LCM）解剖了窦、小动脉、骨内、骨下和非血管区域。与RNA测序相结合的优化的LCM测序可以确定不同区域的间质类群的分布。值得注意的是，作者通过骨切片免疫荧光成像验证了不同间质细胞在各自骨髓区域的位置。最后，他们利用生物信息学方法评估细胞黏附受体及其配体的表达，预测了特定细胞类型与五个骨髓区域的关联。另外，作者使用这种方法来定于不同骨髓区域的分化因子和生长因子的表达模式。

研究路线

之前的研究表明，血管周围间质细胞形成三维网络，包裹和支持骨髓血管。这一群体中的细胞已在Cxcl12-gfp报告小鼠中被鉴定为CAR（CXCL12丰富的网状）细胞，在Nestin-gfp报告小鼠中被鉴定为Nestin - GFPdim细胞，在LepR-cre小鼠中被鉴定为LepR+细胞。这些血管周围间质细胞是造血干细胞生态位的关键组成成分，并产生调节性细胞因子，例如CXCL12和SCF，维持HSC功能。

在这些血管周围的间质细胞群中，功能和细胞异质性显著存在。Baccin等在CAR群体中发现了两个不同的亚群，进一步了解这些小生境的复杂性。基于脂肪细胞(adipocyte)和骨遗传(osteolineage）基因的差异表达，他们将这些群体分别称为Adipo-CAR和Osteo-CAR细胞。值得注意的是，Adipo-CAR细胞显示了与LepR+细胞相似的基因表达模式，这表明它们是相同的群体。这些观察结果非常有趣，正如Morrison实验室做的LepR-cre谱系追踪实验表明LepR+细胞是骨细胞的主要来源，并揭示了LepR+细胞亚群中的脂肪细胞潜能（使用Adipoq-CreER小鼠）。还需要更多的体内研究来阐明LepR+、Adipo-CAR和Osteo-CAR之间的重叠和体外分化潜能。

作者进一步证明，Adipo-CAR细胞在窦中富集，而空间转录组数据表明，Osteo-CAR细胞优先定位于小动脉和非血管的生态位。为了进一步验证这一发现，作者确认了Osteo-CAR细胞表达碱性磷酸酶(Alpl)，并表明与ALPL-Cxcl12+Osteo-CAR细胞相比，ALPL+Cxcl12+Osteo-CAR与窦的联系不那么紧密，与小动脉的联系更加紧密。使用相同的策略，作者还证实了小动脉存在平滑肌细胞(smooth muscle cells)和平足蛋白（PDPN）阳性成纤维细胞（fibroblasts），PDPN+COL1Alow成纤维细胞则局限于骨面骨内膜区域。作者进一步能够从他们的LCM数据中区分单个细胞群和它们的丰度通过使用CIBERSORT和使用流式细胞术和bulk-RNAseq来进一步实验验证。

Baccin等在鉴定了这些以前未被发现的骨髓成分及其定位后，发现每个骨髓区域都有一个独特的细胞因子特征。也就是说，Osteo-CAR和Adipo-CAR细胞是骨髓中造血细胞因子的主要来源，表明不同骨髓区域的造血先祖暴露在不同的细胞因子环境中，进而向不同谱系特化。为了进一步支持这一假设，作者开发了一种计算方法称为RNA-Magnet，以推断间质细胞和造血细胞之间的相互作用。RNA-Magnet根据细胞黏附受体和相关配体的基因表达，绘制了单细胞群体与“吸引”细胞群体之间的物理相互作用。通过这么做，作者可以为两个群体分配权重，描述它们的相对粘附性和相互作用的方向。令人印象深刻的是，该算法证实了作者提出的Adipo-CAR和Osteo-CAR群体的小生境定位，以及之前被证明的细胞群体的小生境定位。

综上所述，Baccin等使用单细胞RNAseq的研究对以往使用单细胞RNA-seq研究正常和紊乱的造血小鼠骨髓微环境的文献进行了补充。随着人类和小鼠造血参考图谱的不断增多，作者提供的流程为识别额外的细胞和分子相互作用以及更好得理解它们在原始造血和疾病中的作用带了巨大希望。总之，每个间质群体的转录组，其在骨髓中的位置、分化和区域性骨髓细胞因子富集和候选相互作用的细胞为未来旨在解密支持造血的特定的血管和骨内膜结构的角色研究提供了宝贵的蓝图。

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