RNAseq质控结果解读:fastqc
1.fastqc报告解读
不同版本fastqc 的报告会有不一样，但是主要有以下几个部分，主要关注Per base sequence quality;Sequence Duplication Levels; Adapter Content。
Basic Statistics: 其他的都好理解，值得注意的是 Sequence length 测序长度；%GC，GC含量，二代测序GC会有偏好性，深度增加，%GC会增加
01_Basic Statistics
Per base sequence quality，序列测序【碱基质量】
横轴代表reads的第1-150个碱基，纵轴是质量得分；蓝线代表均值，红线中位数，黄色区间为25%-75%区间，误差区间为10%-90%。当碱基质量低于10会出现’WARN’，低于5，出现’FAIL’。
碱基质量的计算公式为，\(Q = -10*log10(P_{err})\) ， Q20代表1%的错误率 ，Q30 代表0.1%的错误率。关于fastq Q值和ASCII码的换算以及Phred33与Phred64的判断可以详见这篇博客。
Per sequence quality scores, 测序【序列质量】
横轴为平均碱基质量值，纵坐标为序列数目，大部分大于Q30，说明质量好，如果出现峰值小于Q27（err=0.2%）的时候报’WARN’，小于Q20报’FAIL’。
Per base sequence content,序列碱基含量
04_per_base_sequence_content
统计1-150bp四种碱基出现的频率：正常情况AT、GC含量应该重叠，四条线应该平行且接近；开头会出现偏差由于测序仪不稳定，如果加入了barcode等不均一文库也会产生碱基分离；reads结尾出现的偏离，是接头污染产生的。当AT/CG比例超过10%，报’WARN’,超过20，报’FAIL’。
Per sequence GC content,序列GC含量
05_per_sequence_gc_content
分布函数应该与理论正态分布一致，这里均值接近50；如果分布偏离理论，系统偏差，如果出现多个峰值，表明数据可能有异源污染，可能是接头序列的二聚体污染。偏15%，‘WARN’；偏30%，‘FAIL’
Per base N content,序列碱基N的比例 测序仪测不出来，产生N，测序仪没问题一般N的比例很小。超5%，‘WARN’; 超20%，‘FAIL’
Sequence Length Distribution, 序列长度分布，这里的序列长度是150
07_sequence_length_distribution
Sequence Duplication Levels, 序列重复水平
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红线代表Deduplicated reads(unique reads)，篮线代表总reads，横轴为重复次数，纵轴为重复百分比，具体理解见知乎回答,总reads百分比超过20报’WARN’，超过50报’FAIL’。
RNAseq中这一项一般都会报错。如何理解RNAseq的重复以及如何判断是否需要去重需要很有经验。【下节】详细讨论一下这个问题。
Overrepresented sequences,重复率过高的reads，可能来源Adapter，index，后面需要去除Adapter Content,四种接头的含量，这里Illumina Universal Adapter 含量偏高，后续需要去除。
2. RNAseq 序列重复水平的解释
RNAseq数据的特征，高表达基因的reads数可能普遍偏多，打断后有重复是很正常的事情。